Zelfs goede genbewerkingen kunnen slecht gaan

Newswise – HOUSTON – (24 oktober 2022) – Een laboratorium van de Rice University leidt de inspanningen om potentiële bedreigingen voor de werkzaamheid en veiligheid van therapieën op basis van CRISPR-Cas9, de Nobelprijswinnende techniek voor het bewerken van genen, te onthullen, zelfs als het lijkt om te werken zoals gepland.

Bioengineer Gang Bao van Rice’s George R. Brown School of Engineering en zijn team wijzen er in een paper gepubliceerd in Science Advances op dat hoewel off-target bewerkingen van DNA lange tijd een reden tot zorg zijn geweest, ongeziene veranderingen die gepaard gaan met on-target bewerkingen te herkennen — en te kwantificeren.

Bao merkte op dat een Nature Biotechnology-paper uit 2018 de aanwezigheid van grote deleties aangaf. „Toen begonnen we te onderzoeken wat we kunnen doen om ze te kwantificeren, dankzij CRISPR-Cas9-systemen die zijn ontworpen voor de behandeling van sikkelcelziekte,“ zei hij.

Bao was een groot voorstander van CRISPR-Cas9 als middel om sikkelcelziekte te behandelen, een zoektocht die hem en zijn collega’s steeds dichter bij genezing heeft gebracht. Nu vrezen de onderzoekers dat grote deleties of andere onopgemerkte veranderingen als gevolg van genbewerking in stamcellen kunnen blijven bestaan ​​terwijl ze zich delen en differentiëren, en dus gevolgen hebben voor de gezondheid op lange termijn.

„We hebben geen goed begrip van waarom een ​​paar duizend basen van DNA op de Cas9-cut-site kunnen ontbreken en de dubbelstrengige DNA-breuken nog steeds efficiënt kunnen worden samengevoegd,“ zei Bao. ‚Dat is de eerste vraag en we hebben enkele hypothesen. De tweede is: wat zijn de biologische gevolgen? Grote deleties (LD’s) kunnen nabijgelegen genen bereiken en de expressie van zowel het doelgen als de nabijgelegen genen verstoren. Het is onduidelijk of LD’s kunnen leiden tot de expressie van afgeknotte eiwitten.

„Je zou ook eiwitten kunnen hebben die verkeerd gevouwen zijn, of eiwitten met een extra domein vanwege grote inserties,“ zei hij. „Er kan van alles gebeuren en de cellen kunnen afsterven of abnormale functies hebben.“

Zijn laboratorium ontwikkelde een procedure die single-molecule, real-time (SMRT) sequencing met dubbele unieke moleculaire identifiers (UMI) gebruikt om onbedoelde LD’s te vinden en te kwantificeren, samen met grote inserties en lokale chromosomale herschikkingen die gepaard gaan met kleine inserties/deleties (INDEL’s) op een Cas9 on-target cut-site.

„Om grote genmodificaties te kwantificeren, moeten we langeafstands-PCR uitvoeren, maar dat kan artefacten veroorzaken tijdens DNA-amplificatie,“ zei Bao. “Dus gebruikten we UMI’s van 18 basen als een soort barcode.”

„We voegen ze toe aan de DNA-moleculen die we willen amplificeren om specifieke DNA-moleculen te identificeren als een manier om artefacten als gevolg van langeafstands-PCR te verminderen of te elimineren,“ zei hij. „We hebben ook een bioinformatica-pijplijn ontwikkeld om SMRT-sequencinggegevens te analyseren en de LD’s en grote inserties te kwantificeren.“

De tool van het Bao-lab, LongAmp-seq genaamd (voor lange-amplicon-sequencing), kwantificeert nauwkeurig zowel kleine INDEL’s als grote LD’s. In tegenstelling tot SMRT-seq, waarvoor het gebruik van een long-read sequencer vereist is, die vaak alleen beschikbaar is in een kernfaciliteit, kan LongAmp-seq worden uitgevoerd met behulp van een short-read sequencer.

Om de strategie te testen, gebruikte het laboratoriumteam onder leiding van Rice-alumna Julie Park, nu een assistent-onderzoeksprofessor bio-engineering, Streptococcus pyogenes Cas9 om bètaglobine (HBB), gamma-globine (HBG) en B-cellymfoom/leukemie 11A te bewerken. (BCL11A) versterkers in hematopoëtische stam- en voorlopercellen (HSPC) van patiënten met sikkelcelziekte, en het PD-1-gen in primaire T-cellen.

Ze ontdekten dat grote deleties tot enkele duizenden basen met hoge frequentie optraden in HSPC’s: tot 35,4% in HBB, 14,3% in HBG en 15,2% in BCL11A-genen, evenals op het PD-1 (15,2%)-gen in T -cellen.

Aangezien twee van de specifieke CRISPR-gids-RNA’s die door het Bao-lab zijn getest, worden gebruikt in klinische onderzoeken om sikkelcelziekte te behandelen, zei hij dat het belangrijk is om de biologische gevolgen te bepalen van grote genmodificaties als gevolg van Cas9-geïnduceerde dubbelstrengs breuken.

Bao zei dat het Rice-team momenteel stroomafwaarts kijkt om de gevolgen van lange deleties op boodschapper-RNA te analyseren, de bemiddelaar die code draagt ​​voor ribosomen om eiwitten te maken. „Dan gaan we naar het eiwitniveau,“ zei Bao. „We willen weten of deze grote deleties en inserties aanhouden nadat de gen-bewerkte HSPC’s zijn getransplanteerd in muizen en patiënten“

Co-auteurs van de studie van Rice zijn afgestudeerde studenten Mingming Cao en Yilei Fu, alumni Yidan Pan en Timothy Davis, onderzoeksspecialist Lavanya Saxena, microscopist/bio-instrumentatiespecialist Harshavardhan Deshmukh en Todd Trangen, een assistent-professor informatica, en Vivien van Emory University Sheehan, een universitair hoofddocent kindergeneeskunde.

Bao is de afdelingsvoorzitter en Foyt Family Professor of Bioengineering, een professor in de chemie, materiaalkunde en nanoengineering, en werktuigbouwkunde, en een CPRIT Scholar in Cancer Research.

De National Institutes of Health (R01HL152314, OT2HL154977) steunden het onderzoek.

-30-

Lees de samenvatting op https://www.science.org/doi/0.1126/sciadv.abo7676.

Dit persbericht is online te vinden op https://news.rice.edu/news/2022/even-good-gene-edits-can-go-bad.

Volg Rice News en Media Relations via Twitter @RiceUNews.

Gerelateerde materialen:

Rice lab biedt nieuwe strategieën, tools voor genome editing: https://news2.rice.edu/2016/02/08/rice-lab-offers-new-strategies-tools-for-genome-editing-2/

Nieuwe genetische wapens dagen sikkelcelziekte uit: https://news2.rice.edu/2019/06/03/new-genetic-weapons-challenge-sickle-cell-disease-2/

Bao Lab: http://bao.rice.edu

Rijst Afdeling Bioengineering: https://bioengineering.rice.edu

George R. Brown School of Engineering: https://engineering.rice.edu

Rice University, gelegen op een beboste campus van 300 hectare in Houston, wordt door US News & World Report consequent gerangschikt onder de 20 beste universiteiten van het land. Rice heeft zeer gerespecteerde scholen voor architectuur, bedrijfskunde, voortgezette studies, techniek, geesteswetenschappen, muziek, natuurwetenschappen en sociale wetenschappen en is de thuisbasis van het Baker Institute for Public Policy. Met 4.240 niet-gegradueerden en 3.972 afgestudeerde studenten, is de verhouding student-tot-faculteit van Rice iets minder dan 6-tegen-1. Het residentiële collegesysteem bouwt hechte gemeenschappen en levenslange vriendschappen op, slechts één reden waarom Rice op nummer 1 staat. 1 voor veel interactie tussen race en klasse en nr. 1 voor kwaliteit van leven door de Princeton Review. Rijst wordt ook beoordeeld als de beste waarde onder particuliere universiteiten door Kiplinger’s Personal Finance.

.

Kommentar verfassen

Deine E-Mail-Adresse wird nicht veröffentlicht. Erforderliche Felder sind mit * markiert